RNA 提取及逆转录实验方案

(一) RNA 提取

准备工作：试剂包括 Trizol、无水乙醇、氯仿、异丙醇、PBS（所有试剂均需用 DEPC 水配制，并于冰上预冷）。

1. 细胞清洗：冰上去除培养基，用 PBS 漂洗 3 次以去除血清和酶。
2. 加入 Trizol：六孔板每孔加 $1000\mu l$ Trizol（24孔板每孔加 $200\mu l$），用 $1ml$ 枪头反过来刮取细胞。
3. 冰上裂解：收集至 $1.5ml$ EP 管中，冰上裂解 20 min。
4. 加入氯仿：每管加入 $200\mu l$ 氯仿，上下剧烈摇晃。
5. 注：氯仿为油状，吸取时需慢吸。
6. 静置：冰上静置 10 min。此时透明氯仿层位于上层。
7. 离心：预冷离心机，$4^\circ\text{C}$，12000 rpm，离心 20 min。
8. 分层观察：离心后小心取出 EP 管，不要将分层弄混。
9. 上层：清亮，含 RNA。
10. 中间层：白色蛋白膜。
11. 下层：细胞残余。
12. 吸取上清：吸取 $200\sim 300\mu l$ 上清到新 EP 管，注意绝对不能吸到白色的膜。
13. 沉淀 RNA：加入等体积异丙醇，轻轻颠倒 5 次。
14. 静置：冰上静置 10 min。
15. 离心：$4^\circ\text{C}$，12000 rpm，离心 10 min。
16. 洗涤沉淀：倒掉上清，加入 $1ml$ 75% 乙醇，敲击管底使沉淀（白色羽毛状）悬浮起来。
17. 离心：$4^\circ\text{C}$，8000 rpm，离心 5 min。
18. 二次洗涤：弃上清，加入 $500\mu l$ 无水乙醇。
19. 离心：$4^\circ\text{C}$，8000 rpm，离心 3 min。
20. 干燥：弃上清，空气干燥 10~15 min（RNA 沉淀晾干后呈半透明状）。
21. 溶解：根据 RNA 沉淀量，加入 $10\sim 20\mu l$ DEPC 水溶解（若多个 EP 管可合并溶解至一个 $100\mu l$ 小 EP 管内）。

(二) 测 RNA 浓度

1. 清洁底座：检测前用 $1\mu l$ DEPC 水清洁底座（重复 2~3 次）。
2. 空白对照：用 $1\mu l$ DEPC 水作为空白样本校准。
3. 样本检测：放 $1\mu l$ RNA 样本，测量浓度。样本之间需用 DEPC 水清理底座并用无尘纸擦拭。
4. 记录指标：
5. 浓度：$500\sim 1000 ng/ml$ 为宜。
6. $A_{260}/A_{280}$：$1.8\sim 2.0$ 为宜。
7. $A_{230}/A_{260}$：$1.9\sim 2.3$ 为宜。

(三) 逆转录成 cDNA

• 保存：cDNA 置于 $-20^\circ\text{C}$，RNA 置于 $-80^\circ\text{C}$。
• 体系配置（以诺唯赞逆转录试剂盒为例，$20\mu l$ 体系）：
• RNA 体积：$1000ng \div \text{RNA浓度}$
• Mix (红盖子)：$4\mu l$
• DEPC 水：补足剩余体积
• P.S. 上机前需离心并盖紧盖子。
• 程序设定：
• $55^\circ\text{C}$，15 min
• $85^\circ\text{C}$，5 s
• $4^\circ\text{C}$，保存

(四) 常见问题排查：RNA 浓度低

可能原因：

1. 细胞起始量不足或裂解不充分。
2. 吸取上清量太少。
3. RNA 沉淀未被充分溶解。
4. 操作过程中发生了 RNA 降解。